おすすめ製品　ナカライテスク

HOME > おすすめ製品 > O-Link社　Duolink™ in situ PLA reagent

Olink Bioscience社　Duolink™ in situ PLA


Olink Bioscience社（スウェーデン）は、微量なターゲットの特異的な検出を可能にする独自の増感技術（PLA：Proximity Ligation Assay）を
有しています。IHC（Immunohistochemistry）において、画期的なタンパク質検出システムを紹介します。


■ 特長
  • タンパク質1分子をドットで検出できるレベルまで増感
  • 2種類の一次抗体を用いた原理(Dual Recognition法)により、高い特異性で検出可能
  • 細胞や組織内の内在性タンパク質について2分子間相互作用と局在解析が可能
  • 検出されたドットをカウントすることで、定量的な発現・相互作用の解析が可能
  • 1種類の抗体を用いた簡便なSingle Recognition法を新しく追加


　　　　　 ■ 原理 ■ DuolinkTMのアプリケーション ■ その他の検出方法との比較 ■ 使用例
      　　・Dual Recognition法
　   　　・Single Recognition法
■ Q＆A ■ 製品選択 ■ 製品構成 ■ 価格表


■ 原　理
PLA（Proximity Ligation Assay）法
 ここでは、2種類の一次抗体を使用するDual Recognition法を基に、PLA法の原理について紹介します。
まず、免疫動物とエピトープの異なる2種類（利用可能な免疫動物：mouse、rabbit、goat、chicken、rat、guinea pigの中から2種類）（検出対象物により、同一エピトープの抗体を使用する場合もあります）の一次抗体＊1を作用させます。次に、一次抗体の免疫動物に対応した二次抗体のセットを作用させます。それぞれの二次抗体には特殊な核酸が標識されており、二次抗体が近接した場合（約40nm）のみライゲーション反応により環状構造を形成します。さらに、ポリメラーゼを反応させることにより、環状構造に沿って一本鎖の核酸が伸長されます。伸長された核酸にはあるリピートされた配列が組み込まれることになり、それに対する蛍光標識＊2されたアンチセンスの核酸をハイブリダイゼーションさせて検出します。
図1.一次抗体と二次抗体の結合

サンプルをブロッキングした後、検出目的のタンパク質に対して免疫動物の異なる2種類の一次抗体＊1をサンプル（組織、細胞等）とインキュベーションします。
次にPLA probe MINUSおよびPLA probe PLUS（オリゴヌクレオチド修飾を施した二次抗体）溶液を調製、添加後インキュベーション（37℃、120分間）します。
図2.PLAプローブの結合

次にHybridization solution（2種類のオリゴヌクレオチドから構成）を調製、添加後インキュベーション（37℃、15分間）することでPLA probeとハイブリダイズされ、環状構造が形成されます。
図3.ライゲーション反応

Ligation solution（リガーゼ：図中の黄色部分）を調製、添加後インキュベーション（37℃、15分間）することで、環状構造が完成します。
図4.伸長反応

Amplification solution（オリゴヌクレオチドとポリメラーゼ（図中の黄色部分）から構成）を調製、添加後インキュベーション（37℃、90分間）することで、環状構造に沿って一本鎖の核酸が伸長されます。（RCA法）
図5.蛍光標識プローブの添加

Detection solution（蛍光標識＊2オリゴヌクレオチドプローブ）を調製、添加後インキュベーション（37℃、60分間）することで、修飾オリゴヌクレオチドが伸長させたPLAプローブにハイブリダイズします。
図6.封入剤処理と解析

DuolinkTM Mounting Medium（別売り：メーカー製品番号80100）でサンプルを封入した後、蛍光顕微鏡で解析します。

＊1：一次抗体はお客様でご用意ください。Single Recognition法の場合、1種類の一次抗体を作用させます。
＊2：蛍光色素は、Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)、Detection kit 613（Ex/Em：598/613）のいずれかから選択頂けます。


■ DuolinkTMのアプリケーション

Dual Recognition法
Dual Recognition法では、免疫動物の異なる2種類の一次抗体を用いることで、一分子レベルの高感度・高特異性かつ定量的な解析が可能です。
この特長により以下のアプリケーションに適用できます。
二分子間相互作用の検出
　　
 ＜方法＞
それぞれのターゲットタンパク質に結合する2種類の一次抗体を使用

＜アプリケーション例＞
　・タンパク質相互作用を検出
　・複合体の局在化を検出		 　　
 詳細はこちら
SMAD1/2/3とSMAD4に対する2種類の一次抗体と
本システムを使用して検出（オレンジ色のドット）、サンプル：マウス胎児線維芽細胞をTGF-βで刺激後、検出
りん酸化タンパク質の検出
　　
 ＜方法＞
一次抗体の一方にターゲットタンパク質のりん酸化部位を認識する抗体を使用

＜アプリケーション例＞
　・翻訳後修飾タンパク質を検出
　・翻訳後修飾タンパク質の局在化を検出		 　　
 詳細はこちら
phospho-PDGFとPDGF-β受容体 に対する2種類の一次抗体と本システムを使用して検出（赤色のドット）、サンプル：BJ hTert細胞をPDGF-BBで刺激後、検出
高特異性・高感度検出
　　
 ＜方法＞
1つのターゲットタンパク質に対し、エピトープの異なる2種類の一次抗体を使用

＜アプリケーション例＞
　・タンパク質局在化を検出		 　　
 詳細はこちら
HER2に対する2種類の一次抗体と本システムを使用
して検出（オレンジ色のドット）、サンプル：MDA175細胞
△TOPへ
Single Recognition法
Single Recognition法では、検出目的のタンパク質が1つの場合、1種類の一次抗体を用いるのみで、
簡単に高感度かつ定量的な解析が可能です。但し、Dual Recognition法と比較し、特異性は低下します。
高感度検出
　　
 ＜方法＞
1つのターゲットタンパク質に対し、1種類の一次抗体のみ使用

＜アプリケーション例＞
　・タンパク質局在化を検出		 　　
 詳細はこちら
EGFRに対する1種類の一次抗体と本システムを使用して検出（赤色のドット）、サンプルA431細胞
△TOPへ


■ その他の検出法との比較
本システムは、従来のFRET/BRETなどの蛍光ベースのタンパク質相互作用解析や共免疫沈降法と異なり、細胞や組織など多様な
サンプルについて、内在性タンパク質の相互作用、局在化など様々な情報を一度に得ることが可能です。
Protein Identification Localized Detection Endogenous Proteins Protein Interactions Analyzing 
Tissue Bank 		Unmodified 
Cells
FRET        
BRET        
BiFC        
Co-immunoprecipitation      
Co-localization  
PLA
△TOPへ


■ 使用例
Dual Recognition法
二分子間相互作用の検出　
SMAD1/2/3-SMAD4の相互作用解析
蛍光染色データと
イメージ解析
上段のデータ(A, B)は、本システムを使用しマウス胎児線維芽細胞をTGF-βで未刺激(A)と45分間刺激(B)したサンプルに関する検出結果を示している。SMAD1/2/3（マウス由来）*)とSMAD4（ラビット由来）に対する一次抗体と本システムを用いて検出されたシグナルは、オレンジ色のドットで示されている。核はHoechst 33342（青色）、アクチンはFITC-抗アクチン抗体（緑色）で染色されている。
下段のデータ(C, D)は、上段のデータをMatlab image analysis softwareを用いて、イメージ解析したデータを示している。
TGF-β刺激を行ったサンプルは、SMAD1/2/3とSMAD4の相互作用が生じ、複合体が核に移行することが示されている（図中の白色のドット）。
*)マウス由来のSMAD1/2/3と交差するヒト由来完全長SMAD-1を抗原とした一次抗体を使用しました。
<使用した検出システム>
・DuolinkTM in situ PLA probe anti-mouse MINUS   ・DuolinkTM in situ PLA probe anti-rabbit PLUS
・TexasRed®標識されたプローブ（Ex/Em：583/603）、現在標識プローブは、Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)と
　Detection kit 613（Ex/Em：598/613）の2種類に変更されています。　
・TexasRed® はinvitrogen社の商標です。
核と細胞質における
相互作用の比較
SMAD1/2/3-SMAD4相互作用を表すシグナルの数をカウントし、核と細胞質のそれぞれに分類しグラフにプロットした。65個のTGF-β未刺激の細胞（■）と60個の刺激した細胞（▲）が解析された。このデータによりTGF-βで刺激した細胞は、SMAD1/2/3-SMAD4複合体が核に移行することが示されている。

HER2-EGFRの相互作用解析
蛍光染色データと
イメージ解析
本システムを使用しSK-BR-3細胞における、HER2-EGFRの相互作用を検出した結果を示している。左側のデータ(A)は、HER2（ラビット由来）とphospho-EGFR（ヤギ由来）に対する一次抗体と本システムを用いて検出されたシグナルの画像（赤色のドット（575/605 Filter使用））と青色で染色される核の染色画像（Hoechst 350/461 Filter使用）を重ね合わせたデータである。データ中の数字は、細胞集団の中で任意に付けた数字である。右側のデータ（B）は、BlobFinderイメージ解析プログラムを用いて計測されており、本システムにより検出されたシグナル（白色のドット）は、細胞とバックグラウンドの双方に起因している。核の周辺部分（緑色の縁取り）の任意の部分（黄色と緑色の間の部分）で検出されているシグナルは細胞に起因していることを示す一方、境界線の外側及び核に近接してないシグナルは、バックグラウンドに起因している。
<使用した検出システム>
・DuolinkTM in situ PLA probe anti-mouse MINUS   ・DuolinkTM in situ PLA probe anti-goat PLUS
・TexasRed®標識されたプローブ（Ex/Em：583/603）、現在標識プローブは、Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)とDetection kit
　613（Ex/Em：598/613）の2種類に変更されています。　
・TexasRed® はinvitrogen社の商標です。

りん酸化タンパク質の検出
内在性レベルのPDGF受容体-βのりん酸化レベルの検出
蛍光染色データ
本システムを使用しBJ hTert細胞をPDGF-BB未刺激（A）と60分間刺激（B）したサンプルに関する検出結果を示している。phospho-PDGF(マウス由来)とPDGF受容体-β(ラビット由来)に対する一次抗体と本システムを用いて検出されたシグナルは、赤色のドットで示されている。核はHoechst 33342(青色)で染色されている。本システムを使用することで、内在性タンパク質のりん酸化レベルを比較検討できることを示している。
<使用した検出システム>
・DuolinkTM in situ PLA probe anti-mouse MINUS 　・DuolinkTM in situ PLA probe anti-rabbit PLUS
・TexasRed®　標識されたプローブ（Ex/Em：583/603）、現在標識プローブは、Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)と
　Detection kit 613（Ex/Em：598/613）の2種類に変更されています。
・TexasRed® はinvitrogen社の商標です。
細胞1個あたりのりん酸化のレベルとその集団の割合
1個の細胞あたりのりん酸化された受容体の数
PDGF受容体-βのりん酸化の定量について、BlobFinderソフトウェアにより、239個の未刺激の細胞と275個のPDGF-BB刺激処理を行った細胞のヒストグラム。刺激に応じて、りん酸化された受容体のレベルが上昇することが示されています。
BlobFinder(フリーソフト)は、ウプサラ大学のWebよりダウンロードできます。http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/


高特異性・高感度検出
新しい検出試薬：Detection kit 563を用いたHER2の検出
蛍光染色データ
HER2抗体（マウス由来、ラビット由来の2種類の一次抗体）を用いた本システムの使用結果を示している。HER2に対する一次抗体と本キットを用いて検出されたシグナルは、オレンジ色のドットとして検出されている。
サンプルは、MDA175細胞（+1レベル）を用いた。
<使用した検出システム>
・DuolinkTM in situ PLA probe anti-mouse MINUS　 ・DuolinkTM in situ PLA probe anti-rabbit PLUS
・Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)
△TOPへ
Single Recognition法
EGFRに対する従来の免疫組織染色法との比較
　　　　　　　　　　　　　　サンプル（一次抗体あり） 　　　　　コントロール（一次抗体なし）
一次抗体として、マウス由来のEGFR抗体を用い、本システム（A）と従来の免疫蛍光染色(C)の結果を比較している。従来の免疫蛍光染色には、ロバ由来のTexasRed®　標識抗マウスIgG抗体を二次抗体として用いた。サンプルはA431細胞を用いている。これらの結果から、本システムを用いたサンプルはタンパク質を1分子レベルでドット検出され定量化可能である。一方、従来の免疫蛍光染色は、シグナルが拡散し1分子レベルで検出不可能である。また、コントロールに関しても、本システムを用いた場合(B)は、バックグラウンドシグナルが検出されないが、従来の免疫染色法（D）では検出されている。
<使用した検出システム>
・DuolinkTM in situ PLA probe anti-mouse MINUS・DuolinkTM in situ PLA probe anti-mouse PLUS
・Detection kit 613(Ex/Em：598/613)
・TexasRed® はinvitrogen社の商標です。


siRNA効果の検出への応用（高感度検出）
SMAD4の発現抑制の検出
マウス胎児線維芽細胞におけるSMAD4に対するsiRNAの発現抑制を示している。SMAD4に対して、siRNAを添加した場合（A）と未処理の場合（B）におけるSMAD4の発現を本システムにより検出したデータである。一次抗体は、マウス由来のSMAD4抗体*)を用いた。1分子レベルで検出されたSMAD4は、赤色のドットとして検出されている。核はHoechst 33342（青色）で染色されている。
*)マウス由来のSMAD-4と交差するヒト由来完全長SMAD-4を抗原とした一次抗体を使用しました。
<使用した検出システム>
・DuolinkTM in situ PLA probe anti-mouse MINUS 　・DuolinkTM in situ PLA probe anti-mouse PLUS
・Detection kit 563 (Ex/Em：557/563)
1個の細胞あたりの検出
シグナル数の比較
データはsiRNAを添加した場合と未処理の場合の細胞1個あたりのシグナルの数を示している。siRNAを添加した細胞では、シグナルの数が,1〜10個と減少しており、本システムによりsiRNAの効果を検出できることを示している。
BlobFinder(フリーソフト)は、ウプサラ大学のWebよりダウンロードできます。http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/

ウェスタンブロッティング
の結果との相関
siRNAを添加した場合（B）と未処理の場合(A)の細胞をそれぞれ回収し、ウェスタンブロッティング解析を行った結果を示している。
DuoｌinkTMの検出結果とウェスタンブロッティングの検出結果は相関性がある事を示している。


siRNA研究におけるDuoｌinkTM の利点
方法 正確な定量性 タンパク質発現
レベルでの検出		 局在化解析 1個の細胞レベル
での解析		 微量サンプル
への適応
Real-time PCR ○ × × × ×
ウェスタンブロッティング ○ ○ × × ×
免疫染色 × ○ ○ ○ ○
DuolinkTM システム ○ ○ ○ ○ ○
DuolinkTM システムは、1個の細胞についてタンパク質レベルで解析できることから、従来のsiRNAの評価方法と比較し、
微量のサンプルから様々な情報を得ることが可能です。
△TOPへ


■ Q＆A
Dual Recognition法とSingle Recognition法の違いについての質問
Dual Recognition法とSingle Recognition法の違いについて Single Recognition法では、1種類の一次抗体を使用します。
2種類の抗体を使用するDual Recognition法と比較し、主な差異は以下の通りです。
　1)使用条件の検討が容易
　2)特異性はDual Recognitionより低下
　3)分子間の相互作用解析には使用不可
　4）検出感度は同等
条件検討についての質問
使用条件の検討 まず一次抗体が機能する条件を確認する事が、本システムの検出に重要です。通常行われている免疫染色法またはSingle Recognition法により、事前に一次抗体が機能する条件を確定してください。
サンプルについての質問
使用可能なサンプル 本システムは、付着細胞、ホルマリン固定パラフィン包埋処理を施した細胞など様々なサンプルに使用可能です。現在、組織切片に対しては、多くの例を有していませんが、保有している例では充分な結果が得られています。
サンプルの前処理 抗原の賦活化については、一般的な熱処理とProteinase Kを用いた処理法で問題ありません。固定化に関しては、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、亜鉛、エタノール、アセトンなどの様々な固定化法が適用可能です。
ブロッキング 現在使用されている抗体の希釈やサンプルのブロッキングに使用されているブロッキング溶液を使用して頂くことは可能です。特にブロッキング溶液が限定されていない場合は、製品添付のブロッキング溶液をご使用ください。
退色防止剤について DuolinkTM　Mounting Mediumをご用意しています。
一次抗体の選択についての質問
PLA標識二次抗体の一次抗体への選択性について DuolinkTM in situ PLA probe kitに使用されているPLA標識二次抗体は、anti-chicken MINUS(PLUS) kitの場合、chicken total IgYを抗原（免疫動物：donkey）として作製されています。その他のkitは、全てtotal IgGを抗原（免疫動物：donkey）として作製されており、一次抗体のサブクラスは問いません。
モノマーを抗原とした検出 エピトープ、宿主の異なる2種類の一次抗体を使用してください。例えば、りん酸化抗体で検出する場合、一方の抗体はりん酸化部位を認識する抗体、他方は他のエピトープ部位を認識する抗体を使用することで検出可能です。
ヘテロダイマーを抗原とした検出 それぞれのモノマータンパク質に特異的な宿主の異なる一次抗体を使用することで検出可能です。例えば、一方の抗体にりん酸化抗体等を用いると、翻訳後修飾されたタンパク質のヘテロダイマー検出も可能となります。
ホモダイマーを抗原とした検出 同じエピトープを認識し、宿主の異なる2種類の一次抗体を使用してください。それぞれの抗体は、高い特異性を持つ抗体で最適化する必要があります（一方の抗体の結合が過剰とならないように必ず抗体のタイトレーション試験を実施してください）。
その他の質問
サンプル由来の核酸に対する標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの可能性 可能性はありますが、PLA伸長により増幅された核酸とサンプル由来の増幅されていない核酸とは、シグナル強度が全く違う事から問題ありません。
生細胞への適応の可否について 本システムは、固定化処理が必須となります。従って、原則として生細胞では使用でません。
△TOPへ


■ 製品選択
本システムでは、Probe MINUS、Probe PLUS、Detcition kitが必要となります。
Probe MINUS、Probe PLUSは6種×2容量、Detcition kitは、2種×2容量のラインナップになってなっています。
各々から適切なものを1種ずつ選択してください。容量はそれぞれ30回用と100回用の2容量があります。
※mouseとratの組み合わせは相互に交差することがあるため推奨いたしません。

よく使用される組合せ例
組み合わせ番号 PLA probe anti-X MINUS PLA probe anti-X PLUS Detection kit
24288-04 DuolinkTM 30 PLA probe anti-Mouse MINUS DuolinkTM 30 PLA probe anti-Rabbit PLUS DuolinkTM 30 Detection kit 613
24289-94 DuolinkTM 30 PLA probe anti-Rabbit MINUS DuolinkTM 30 PLA probe anti-Goat PLUS DuolinkTM 30 Detection kit 613
24290-54 DuolinkTM 30 PLA probe anti-Mouse MINUS DuolinkTM 30 PLA probe anti-Goat PLUS DuolinkTM 30 Detection kit 613
△TOPへ


■ 製品構成
製品 製品構成
DuolinkTM PLA probe anti-X MINUS
DuolinkTM PLA probe anti-X PLUS		 Blocking stock(5X)
Antibody Diluent stock(5X)
PLA probe anti-X PLUS(MINUS) stock
DuoLinkTM in situ PLA Detection Hybridization stock(5X)
Ligase(1U/μl)
Ligation stock(5X)
Polymerase(10U/μl)
Amplification stock(5X)
Detection stock(5X)
△TOPへ


■ 価格表
製品名 メーカー製品番号 容量 価格
PLA probe anti-X MINUS
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Mouse MINUS 90601 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Rabbit MINUS 90602 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Goat MINUS 90603 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Chicken MINUS 90604 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Rat MINUS 90605 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Guinea pig MINUS 90606 30 reactions 52,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Mouse MINUS 90201 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Rabbit MINUS 90202 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Goat MINUS 90203 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Chicken MINUS 90204 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Rat MINUS 90205 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Guinea pig MINUS 90206 100 reactions 92,000
PLA probe anti-X PLUS
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Mouse PLUS 90701 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Rabbit PLUS 90702 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Goat PLUS 90703 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Chicken PLUS 90704 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Rat PLUS 90705 30 reactions 52,000
DuolinkTM 30 PLA probe anti-Guinea pig PLUS 90706 30 reactions 52,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Mouse PLUS 90301 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Rabbit PLUS 90302 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Goat PLUS 90303 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Chicken PLUS 90304 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Rat PLUS 90305 100 reactions 92,000
DuolinkTM 100 PLA probe anti-Guinea pig PLUS 90306 100 reactions 92,000
Detection kit
DuolinkTM 30 Detection kit 613 90133 30 reactions 58,000
DuolinkTM 30 Detection kit 563 90134 30 reactions 58,000
DuolinkTM 100 Detection kit 613 90103 100 reactions 108,000
DuolinkTM 100 Detection kit 563 90104 100 reactions 108,000
その他
DuolinkTM Mounting Medium 80100 10　ml 47,000
DuolinkTM Wash Buffer 80152 1 set 5,000
※掲載の内容は、'08年07月現在の情報に基づいております。


HOME > おすすめ製品 > O-Link社　DuolinkTM in situ PLA reagent
(C)2008 ナカライテスク株式会社　　■製品に関するお問合せ　E-mail:info-web@nacalai.co.jp