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Molecular Targeting Technologies社
神経軸索トレーシング用蛍光色素コーティングフィルター
NeuroVue®
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本品は、神経軸索のトレーシングに使用する色素をコートしたナイロンフィルターで、結晶タイプや液体タイプに比べ、神経細胞イメージングに非常に使いやすい製品です。他手法のマイクロインジェクション法に比べ細胞の損傷が少なく、高分解能で神経軸索伸長をモニタリングすることができます。 |
■ 特長
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- 5種類の異なる色素でマルチカラー解析が可能
- 高圧のマイクロインジェクション法よりも細胞損傷が少ない
- 取扱いが簡単で目的の場所に的確にセット可能
- 挿入部位から順行性および逆行性の両方向に染色可能
- 神経細胞の同定に必要な受容体を欠いている胚においてもニューロン結合の研究が可能
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■ 使用手順
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■ 使用例 |
図1. 脳のホールマウントの顔部分と頭がい部分を神経トレーシングした共焦点映像
<下図の左の蛍光イメージ：緑色：迷走神経、赤色：三叉神経、紺色：顔部/VIII/舌咽神経> |
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| グリセロール中の脳のホールマウント。右側の共焦点映像A及びBは、上図の四角で囲まれたA及びB部分の共焦点映像を撮影したもの。 |
映像は、BioRad社Radiance 2000 confocal system、励起波長488nm、568nm、637nmを用いて映像化した。NeuroVue® Green、Red、Maroonは、それぞれ500nm、650nmの2色性ミラーと515/40nm BP、600/40nm BP、660nm LPを用いて検出した。 |
E12.5 マウス胚の脳ホールマウント（左図）及びその中心射影（図A及びB）。迷走神経、三叉神経、顔部/VIII/舌咽神経をそれぞれ、NeuroVue® Green、Red、Maroonを用いてラベル化した。
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| 本使用例では、緑色の色素としてNeuroVue® Greenが使用されていますが、現在はNeuroVue® Greenと同様にご使用いただける改良品NeuroVue® Emeraldを販売しています。 |
図2. Murine内耳蝸牛の表面サンプルの神経分布の共焦点映像
通常観測することが困難とされる、非常に薄いType II inner hair cell (IHC)も単一の神経線維レベルで可視化できる。 |
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Murineの内耳をNeuroVue® Red（red pseudocolor）、NeuroVue® Maroon（green pseudocolor）により2重ラベルした後、outer hair cell(OHC)及びinner hair cell(IHC)の求心性神経及び遠心性神経線維を低、中、高解像度で映像化した。
例1（左図；Scale bar=2mm）は、蝸牛軸にNeuroVue® Redを用いてラベル化されており（図3参照）、全ての蝸牛の神経線維が強力にラベル化されている。例2（図中央及び右図）は、蝸牛軸はラベル化されていないが、左図の図式化（図中の赤色及び緑色の長方形）部位の尖端にNeuroVue® Red、NeuroVue® Maroonのマイクロストリップが挿入されている。このように尖端に挿入することで、わずかな神経線維のラベル化を可能とし、中解像度（図中央；Scale bar=100µm）及び高解像度（右図；Scale bar=10µm）で、OHC及びIHCそれぞれのタイプII求心性神経（赤色）及び遠心性神経線維の分岐（緑色）を鮮明に可視化することが可能である。生後1週間（P7）のmurine蝸牛表層は以下の操作でラベル化された。色素は、4%ホルムアルデヒド（in PBS）、37℃、48時間の条件でインキューベーションした。 |
図3.
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蝸牛の断面のイメージングにおける、murine内耳細胞の放射状の神経線維とコルチ器官の支持細胞との相互作用を観測した共焦点映像 |
| <下図の左の蛍光イメージ：赤色：神経線維、緑色：PLP-eGFP遺伝子が発現した細胞> |
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| Low power (scale bar =100µm) |
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| High power (scale bar =10µm) |
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eGFP(green pseudocolor)とNeuroVue® Red（red pseudocolor）により2重ラベル化することで、内耳の神経線維及びトランス遺伝子によりラベル化された細胞を高解像度で映像化することが可能である。
（Morris et al., Brain Res 1091：186-199 2006）。
左図：NeuroVue® Redでラベル化した神経線維の共焦点映像（red pseudocolor）とPLP-eGFP(green
pseudocolor)でラベル化された細胞(green pseudocolor)の単一光映像を重ね合わせた映像。この映像より、PLP-eGFPを発現しているのは、らせん状のガングリオン細胞を囲むSchwann細胞及びコルチ器官の支持細胞である。これらの細胞は、黄色の細切れのようにイメージングされる。
右図：NeuroVue® Redで赤色にラベル化された神経線維がeGFPラベル化された支持細胞を通って伸張していくのがわかる。 |
| 図4. 2色の神経トレーシング色素を用いて、別々に撮った組織イメージを解剖学的に重ね合わせた図
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| 卵形嚢にNeuroVue® Maroon（図A：green pseudocolor）、蝸牛にNeuroVue® Red（図B：red pseudocolor）を用い2重ラベルすることで、E18.5マウス後脳の脳幹において、重複している細胞や神経線維の分布を可視化することが可能である。37℃、96時間の条件で、NeuroVue® とインキューベーションした後、15%ゼラチン上で、vibratomeを用いて100µmの切片を作製した。作製された切片はグリセロールでマウントし、NeuroVue® Redに関しては励起波長：543nm、検出波長：565-615nmの条件で、NeuroVue® Maroonに関しては励起波長：633nm、検出波長：650-710nmの条件で、Zeiss LSM 510 Meta confocal systemを用いて映像化した。映像Aと映像Bを重ね合わせていない映像では、各々の色素により、単一の細胞及び線維レベルを映像化することが可能である。映像Aと映像Bを重ね合わせた映像（図C）では、前庭神経核求心性線維は、NeuroVue® Maroonのみにラベル化され、蝸牛神経核求心性線維は、NeuroVue® Redのみにラベル化されている。その一方で、双方の神経線維が重複している部分（yellow pseudocolor）は、前庭蝸牛遠心性束で確認される。Scale bar=100µm
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■ 参考
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| ● 色素拡散速度例 |
| 色素が拡散する速さは、i)目的とする部位までの距離、ii）NeuroVue® 色素の濃度、iii)インキュベーション温度、iv)組織の固定度合（固定化剤の濃度、固定化時間）などのパラメーターによって変ります。 |
| マウス（耳〜脳）組織を用いたときの拡散時間 |
| 発達段階 |
時間(37℃) |
| Embryonic day 11.5 (E11.5) |
24-36時間 |
| Embryonic day 13.5 (E13.5) |
48-60時間 |
| Embryonic day 16.5 (E16.5) |
72-80時間 |
| Newborn (P0) |
80-96時間 |
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● 各NeuroVue® の蛍光特性 |
| メーカー製品番号 |
製品名 |
励起波長
(Max) |
蛍光波長
(Max) |
分子吸光係数
(M-1cm-1) |
| FS-1001 |
NeuroVue® Maroon |
647 nm |
667 nm |
222,368 |
| FS-1002 |
NeuroVue® Red |
567 nm |
588 nm |
135,000 |
| FS-1003 |
NeuroVue® Orange |
550 nm |
570 nm |
139,800 |
| FS-1004 |
NeuroVue® Emerald |
494 nm |
505 nm |
101,766 |
| FS-1005 |
NeuroVue® Burgundy |
683 nm |
707 nm |
192,832 |
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● マルチカラー解析時のNeuroVue®の選択例 |
| 励起・検出装置に適したNeuroVue®を選択してください。 |
| マルチカラー |
NeuroVue®の組合せ |
装置 |
| 3カラー解析(≦48時間) |
NeuroVue® Emerald*
NeuroVue® Red
NeuroVue® Maroon
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標準的な落射蛍光顕微鏡共焦点システム
（励起：488、568、633/647nm） |
NeuroVue® Emerald*
NeuroVue® Orange
NeuroVue® Maroon |
標準的な落射蛍光顕微鏡共焦点システム
（励起：488、543、633/647nm） |
| 4カラー解析(3-4週間) |
NeuroVue® Orange
NeuroVue® Red
NeuroVue® Maroon
NeuroVue® Burgundy |
スペクトル検出可能な システム
（Spectral Unmixing機能必須：Orange/RedとMaroon/Burgundyの重複しているスペクトル特性を正確に分離できる装置） |
| 5カラー解析(≦48時間) |
NeuroVue® Emerald*
NeuroVue® Orange
NeuroVue® Red
NeuroVue® Maroon
NeuroVue® Burgundy |
*緑色や黄色の自家蛍光が高くなるとされている成人組織の研究や48時間以上にわたる神経プロファイル研究の場合は、より長波長側のNeuroVue® 色素をご使用ください。
Reference：Compatible with green fluorescent genetic markers such as eGFP or photoactivated
X-Gal reaction product BCI [Matei, Brain Res Bull 70:33-43, 2006] |
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Sold under sublicense from PTI Research, Inc.
NeuroVue® are trademarks of PTI Research, Inc. used under license. |
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■ 価格表
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| 製品名 |
メーカー製品番号 |
容量 |
価格 |
| NeuroVue® Maroon |
FS-1001 |
1 cm2 |
71,000 |
| NeuroVue® Red |
FS-1002 |
1 cm2 |
71,000 |
| NeuroVue® Orange |
FS-1003 |
1 cm2 |
71,000 |
| NeuroVue® Emerald |
FS-1004 |
1 cm2 |
71,000 |
| NeuroVue® Burgundy |
FS-1005 |
1 cm2 |
71,000 |
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| ※掲載の内容は、'07年9月現在の情報に基づいております。 |
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